Nobelova nagrada u kemiji - 2018 • Tatiana Romanovskaya • Znanstvena vijest o "Elementama" • Nobelove nagrade, kemiju, molekularnu biologiju

Nobelova nagrada u kemiji – 2018

Sl. 1. Dobitnici Nobelove nagrade u kemiji 2018. godine. S lijeva na desno: Frances H. Arnold, George P. Smith i Sir Gregory P. Winter. Fotografije iz sciencenews.org

Nobelovu nagradu u kemiji 2018. godine dijele trojica znanstvenika: polovica nagrade pripala je američkom istraživaču Francisu Arnoldu "za usmjerenu evoluciju enzima", drugu polovicu podjednako su podijelili američki George Smith i Greg Winter iz Velike Britanije – "za prikaz faga peptida i protutijela". Studije koje su osvojile nagradu imaju izraženi primijenjeni karakter i ujedinjuju činjenica da su svi autori u pitanju razvoj metoda za dobivanje korisnih proteina i peptida za ljude na temelju imitacije prirodne "metode" biološke evolucije, naime, kombinacijom slučajne varijabilnosti i ne-slučajni odabir. Svi pobjednici imaju dug put istraživačkog rada i mnoge prestižne nagrade i nagrade.

Proteini (koji se nazivaju i polipeptidi) najvažnija su skupina biopolimera. Svaki polipeptid je lanac aminokiselina povezanih jedan za drugim, čiji broj može biti vrlo različit, od nekoliko komada do nekoliko stotina, a ponekad čak i više od tisuću.Kratki lanci (manje od stotinu aminokiselina) obično ne nazivaju proteinima, već peptidima: razlika je ovdje kvantitativna nego kvalitativna. U prirodi, proteini se uglavnom temelje na dvadeset vrsta aminokiselina. Polipeptidni lancovi se zatim preklapaju na određeni način, dobivaju različite prostorne konfiguracije, pretvarajući se u nešto poput detalja LEGO dizajera (slika 2).

Sl. 2. Primjeri molekula proteina; Prikazani su modeli svoje trodimenzionalne konfiguracije. Slika od L. L. Porter, G.D. Rose, 2012. Termodinamička definicija proteina domena

Važnost proteina za divlje životinje ne može se prenaglašavati. Prvo, bjelančevine su građevni blokovi od kojih se žive stanice sami grade i kostur međustanične supstance na koju se stanice pridaju. Možete jasno vidjeti da ako uzmemo, na primjer, srce i ukloniti ga iz svih stanica (postupak zove detsellyulyarizatsiey), protein kralježnica, koja je u ovom slučaju u potpunosti sačuvati oblik punog tijela (vidi. Day sliku „Detsellyulyarizovannoe srca”).

Drugo, značajan dio proteina su enzimi, tj. Oni su biološki katalizatori koji imaju niz važnih osobitosti i prednosti u usporedbi s konvencionalnim kemijskim katalizatorima neproteinske prirode.Naime, neuobičajeno visoka učinkovitost, specifičnost za određenu vrstu supstrata i kontrolu: enzim pod utjecajem određenih vanjskih čimbenika ili preko interakcije s njim drugog proteina može proći od aktivnog oblika do neaktivnog i obrnuto.

Treće, neki proteini – antitijela – služe kao nano oružje protiv neprijateljskih sredstava (bakterija, virusa ili toksina) koji ulaze u tijelo iz vanjskog okruženja i tako obavljaju zaštitnu funkciju. To se osigurava sposobnošću protutijela da se čvrsto vežu sa širokim rasponom antigenskih molekula.

A onda postoje receptorski proteini koji dozvoljavaju živućim stanicama da percipiraju signale (kemijske ili fizikalne) od vanjskog okruženja, kao i proteini regulatora koji kontroliraju reakcije stanica na primljene signale, posebice aktivirajući ili inaktivirajući određene enzime (receptore i Još jedna Nobelova nagrada ove godine je posvećena – u fiziologiji i medicini, pogledajte vijesti Nobelova nagrada u fiziologiji i medicini – 2018, "Elementi", 04.10.2018).

Ne postoji ništa iznenađujuće u činjenici da ljudi vide izgledi za ukroćenje tih izvanrednih molekula kako bi riješili širok raspon zadataka koji nadilaze čisto prirodne procese.Željeli bismo stvoriti nove vrste katalizatora koje nije izumio samo priroda, kao i proteini i peptidi koji bi učinkovito vezali bilo koju vrstu molekula koje nas zanimaju.

Da bi dobili nove proteine ​​s danim svojstvima, oni, u teoriji, prvo moraju biti izmisljeni. Svojstva proteina ovise o prostornoj konformaciji proteinske molekule, kao io raspodjeli električnih naboja u molekuli. Ove karakteristike, zauzvrat, određene su svojstvima aminokiselina koje čine protein. Štoviše, važno je ne samo koje aminokiseline i količinu ulaze u lanac, već i u kojoj se mjeri nalaze. Teoretski, znajući svojstva aminokiselina i strukturu polipeptidnog lanca, moglo bi se predvidjeti konfiguracija i kemijska svojstva konačnog proteina. A ako je tako, zašto ne bi reinventirali proteine ​​za svoje potrebe na isti način na koji inženjeri izmisle sve vrste tehničkih uređaja – od kemijskih olovaka do računala? Jao, nije tako jednostavno. Činjenica je da često za isti lanac aminokiselina postoji nekoliko mogućih stabilnih konfiguracija, a osim toga, u vrijeme interakcije s drugim molekulama u reakcijskoj smjesi, konfiguracija se može promijeniti zbog preraspodjele naboja u molekuli.Sve to čini iznimno teško za "racionalni dizajn" novih bitnih proteina i peptida.

Postoji izlaz iz te poteškoće, i to je izumio milijarde godina od samog prirode – to je metoda pokušaja i pogrešaka: stvaranje slučajne raznolikosti, a zatim odabir proizvoda koji imaju potrebna svojstva. To je zapravo "metoda" prirodne evolucije bjelančevina, a za ovu se godinu nagrađivalo Nobelovu nagradu u kemiji za svrhu laboratorijskog proteinskog inženjeringa na principu darvinističke evolucije.

Nagrada je podijeljena u dva dijela zbog dobrog razloga – pristupi koje je Frances H. Arnold upotrijebio za "usmjerenu evoluciju enzima" značajno se razlikuju od pristupa "faga prikazivanja" koju je razvio George P. Smith i prilagodio ga Gregory Winter (Sir Gregory P. Winter) da se dobiju specifični peptidi i antitijela. Stoga, mi također uzimamo u obzir ove dvije dijelove zasebno.

Sl. 3. Plakat pored laboratorija Franje Arnolda u Caltechu. Fotografija © N.V.

Francis Arnold je 1993. godine dobio svoj prvi "ne-prirodni" enzim (K. Chen, F.H. Arnold, 1993. Tuning za dimetilformamid).Zatim je dobivena nova varijanta enzima subtilizina E koja katalizira cijepanje i stvaranje peptidnih veza (spojeva između aminokiselina u peptidnim lancima), a zahvaljujući metodi usmjerene evolucije i uvođenju 10 aminokiselinskih supstitucija u izvorni prirodni protein, bilo je moguće načiniti enzim u organskom otapalu ( 60% dimetilformamid) i povećati toplinsku stabilnost za 18 stupnjeva. Iz tehničkih razloga, često je potrebno provesti neke reakcije kemijske sinteze u organskim otapalima pri povišenim temperaturama, pa je taj rezultat od velike važnosti za praktičnu kemiju.

Rad je prošao kroz sljedeće faze: prvo, pronađen je odgovarajući prirodni gen. Odabir gena za početak nije uvijek jednostavno pitanje. Prema Francesu Arnoldu, ponekad je riječ o intuiciji. Ali opće je načelo, ako je moguće, pokušati pronaći protein koji pokazuje sposobnost da katalizira željenu reakciju, barem u vrlo slabom stupnju. Odabrani gen umetnut je u plazmid (kružna DNA molekula) tako da se može razmnožavati u bakterijama – crijevnim štapovima – ovo je prilično standardan postupak u genetskom inženjerstvu (vidi detaljni prikaz toga).Nadalje, korištenjem lančane reakcije polimeraze (PCR), u ovaj su geni uvedeni četiri preformulirane supstitucije. U ovoj fazi znanstvenici su vođeni računalima temeljenim na računalnoj simulaciji. Ove zamjene trebale su se u željenom smjeru promijeniti u obliku aktivnog centra enzima i osigurati njegov učinkovitiji rad pod traženim uvjetima. Potrebne zamjene su uvedene koristeći primere koji sadrže supstituirane nukleotide. Zatim je do bakterija – u procesu rasta i podjele razmnožavaju plazmid i istodobno sintetiziraju proteine ​​kodirane u ovom plazmidu. Nakon toga, protein se izolira i testira na razinu enzimske aktivnosti.

Aktivnost je i dalje preniska. Da bi se poboljšao rezultat, u sljedećoj fazi, gen je prolazio kroz tri kruga "mutagenog PCR". U takvim PCR-om, mutacije se uvode slučajno zbog posebno odabranih uvjeta, kao što je to što DNA enzim polimeraze čini "pogreške" češće nego inače. Nakon svake runde, geni su uvedeni u bakterije, enzim je izoliran i provjera (masena ispitivanja) provedena je kako bi se pronašla najučinkovitija radna varijanta.Kao rezultat toga, u vjeveru su se pojavile još šest dodatnih zamjena, a voila! – dobije se potreban visoko učinkovit enzim.

U budućnosti, Francis Arnold, kao i drugi istraživači, koji su usvojili metodu koju je predložila, dobili su mnogo više korisnih enzima s neobičnim svojstvima. Tehnika je poboljšana: metode su dodane metodama generiranja slučajnih mutacija, koje također pružaju slučajnu razmjenu regija između mutiranih sekvenci. Ili, alternativno, koristi se razmjena područja između prirodnih gena koji čine veliku obitelj gena – tijekom evolucijske povijesti prirodno su nakupile mnoge mutacije, a kombinatorni pristup može pomoći na osnovi dobivanja enzima s novim svojstvima.

Dakle, rad na dobivanju katalizatora za neobične kemijske reakcije s P450 obitelji citokrom gena pokazao se vrlo plodonosnim. U sl. Slika 4 prikazuje djelomični popis prirodnih i "neprirodnih" reakcija koje katalizira ova skupina enzima.

Sl. 4. Reakcije koje katalizira prirodni citokrom P450 (u lijevoj polovici slike, na plavoj pozadini) i novi enzimi dobiveni na temelju njihove metode usmjerene evolucije: 1 – ciklopropanata, 2 – azidaciju, 3 – sulfimidacija, 4 – aminacija C-H veze, 5 – umetanje N-H komunikacije. U sredini pokazuje generalizirani model trodimenzionalne konfiguracije citokroma P450. Oznaka: R je bilo koji radikal, Ar je aromatski radikal, Ts je tosil. Reakcije prikazane na ružičastoj pozadini ne postoje u prirodi (ili barem još nisu otkrivene). Slika iz članka F. Arnold, 2015. Priroda kemijske inovacije: novi enzimi evolucijom

Opća shema usmjerene evolucije enzima, u svom modernom obliku, prikazana je u sl. 5.

Sl. 5. Dijagram procesa koji se koriste u bjelančevini. Metoda "slučajnog pretraživanja" koja podrazumijeva usmjerenu evoluciju proteina (na lijevoj strani), mogu se u određenoj mjeri kombinirati s racionalnim dizajnom, zasnovanim na poznavanju zakona odnosa između strukture i funkcija proteina koji se koriste u programima virtualnog modeliranja. Slika iz članka V. Stepankova i sur., 2013. Strategije za enzime u organskim otapalima

Dakle, praktična izlazna djela Franje Arnoldovog je da je metodom koju je predložila moguće dobiti katalizatore za reakcije koje se koriste u farmaceutskoj industriji i za sintezu umjetnihmaterijali koji se ne pojavljuju u prirodi (na primjer, stvaranje veze između atoma ugljika i atoma silicija) ili se moraju izvoditi pod abnormalnim uvjetima (u prisutnosti organskih otapala ili kemikalija, pri visokim ili niskim temperaturama itd.). Ali, osim toga, postoji temeljna vrijednost: što više laboratorija dobivaju različite proteine, čija se kemijska i fizikalna svojstva naknadno proučavaju i uspoređuju, poboljšavajući razumijevanje fizike biopolimera, to je veća prediktivna snaga virtualnih modela za ciljani dizajn željenih proteina ili za predviđanje postaje svojstva još neistraženih prirodnih proteina.

Sada razgovarajmo o načinu prikaza faga. Izvorna verzija metode razvila je George Smith 1985. godine. Metoda se temelji na uporabi bakteriofaga M13, koji se umnožava u bakterijama – crijevnim štapićima (E. coli). Fag M13 je dobar po tome što je njegov kapsid dovoljno velik za smještaj genoma faga zajedno s umetcima, čak i velikim. Bit metode prikazivanja faga jest da fragment koji kodira peptid od interesa za nas, ili cijeli protein ili niz različitih fragmenata umetnemo u genom bakteriofaga.U svom najjednostavnijem obliku, to može biti zbirka potpuno nasumičnih sekvenci. Ugrađivanje se provodi u okviru čitanja jednog od gena koji kodiraju kapsidne proteine ​​(ima pet takvih proteina u M13). Kao rezultat takvog umetanja fragmenta, peptidi koji su kodirani u ovom fragmentu izloženi su (u kombinaciji s vlastitim proteinima faga) koji su kodirani u fragmentu. Fagi se razmnožavaju u bakterijama – i kako se razmnožavaju, oni se mijenjaju s nekom frekvencijom. Kao rezultat, nakon ekstrakcije čestica faga iz zaraženih bakterija (milijardi čestica po krugu), dobivamo niz različitih verzija originalnog umetnutog fragmenta i peptida koji je kodirao ovaj fragment. Sve ove verzije prikazat će se na površini faga – to je "faga prikaz". Tako dobivamo primarnu biblioteku čestica faga.

Fagalne čestice se tada mogu odabrati zbog svoje sposobnosti vezanja na željene molekule, a zatim one čestice koje su odabrane jer se vežu bolje od drugih mogu se ponovno upotrijebiti za inficiranje bakterija. Izbor se vrši pomoću celuloznih filtera ili magnetskog zrna,na kojem su potrebne molekule fiksne (kako bi se dobio ideju o tome kako se prikupljaju potrebne molekule za magnetske zrnce, može se vidjeti promatranjem malog videozapisa). "Pravi" faga ostat će na medijima, a "pogrešni" će biti bezobzirno oprati. Praksa prikaza faga pokazuje da je samo pet krugova dovoljno za dobivanje peptida s vrlo visokom učinkovitosti vezivanja. Zatim se sekvenciraju uzorci DNK koji su izolirani iz faga, a na temelju odabranog slijeda selekcije istraživač može sastaviti genetske konstrukte koji će omogućiti dobivanje potrebnih proteina u traženim količinama u bilo kojem pogodnom predmetu – na primjer, u istim crijevnim štapićem ili kvasac. Ova metoda, Greg Winter, još jedan dobitnik nagrade, prilagođen je proizvodnji antitijela na specifične antigene. Shema koju je koristio prikazan je na sl. 6.

Sl. 6. Shema za dobivanje protutijela pomoću prikaza faga. Slika C.J. Rossant i sur., 2014. CXCR2

Značajna prednost metode zime je prvenstveno izbjegavanje potrebe za imuniziranim životinjama za proizvodnju protutijela i hibridoma (hibrida limfocita i stanica raka) za njihovu masovnu proizvodnju. Prikaz faga – brža, jeftinija i humana tehnika.Dodatno, ova metoda omogućuje dobivanje čistih ljudskih antitijela, što je važno ako se antitijela koriste kao lijek – nakon svega, antitijela životinja koja su unesena u ljudsko tijelo bi same izazvala snažan imunološki odgovor kod ljudi.

Ako je potrebno dobiti ne samo učinkovitu već i specifičnu vezu, neće biti teško uključiti u opću shemu fazu selekcije na čestice koje ne reagiraju selektivno. Trenutno, faga se koristi ne samo u malim laboratorijima već iu masovnoj proizvodnji lijekova i reagensa baziranih na protutijelima (i informacije o peptidima koji vežu različite antigene prikupljaju se u javno dostupnom BDB bazu podataka). Ovdje su samo neka područja primjene: otkrivanje antigena u testnim uzorcima (posebno za dijagnostičke svrhe), priprema cjepiva, antitumorska protutijela, protutijela za suzbijanje autoimunih reakcija, antitoxine, ciljana doza lijeka u oboljelih tkiva (uključujući rak). U posljednjem je desetljeću ova tehnologija naučila primijeniti za učinkovitije evoluciju i selekciju proteina enzimskom aktivnošću.

Zaključno, trebali bismo reći da nismo na kraju ceste, već samo na početku (kao i obično). Potreba za korištenjem metode slučajnih pretraživanja govori nam kako malo još uvijek znamo i koliko su slabe naše prediktivne mogućnosti. No, kako se akumulira znanje stečeno probom i pogreškom, još uvijek se krećemo prema povećanju rezolucije slike kojom sudimo svijet oko nas.

Tatyana Romanovskaya


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: