Nobelova nagrada u kemiji - 2017. • Arkadij Kuramshin • Znanstvena vijest o "elementima" • Nobelove nagrade, mikrobiologiju, molekularnu biologiju, tehnologiju

Nobelova nagrada u kemiji – 2017

Sl. 1. Dobitnici Nobelove nagrade u kemiji 2017. S lijeva na desno: Jacques Dubose, Joachim Frank i Richard Henderson. Fotografije iz sciencenews.org

Prošlog je tjedna objavljeno da će švicarska njemačka Nobelova nagrada za kemiju 2017. godine primiti švicarski Jacques Dubose, njemački američki Joachim Frank i Škot Richard Henderson za "razvoj metoda visoke razlučivosti krioelektronske mikroskopije za određivanje trodimenzionalnih struktura biomolekula u otopini. Njihov rad dopuštao je, počevši od osamdesetih godina prošlog stoljeća, testirati i postupno poboljšati ovu vrstu mikroskopije do te mjere da znanstvenici u posljednjim godinama mogu istražiti složene biološke molekule u najmanjim detaljima. Nobelovo povjerenstvo napomenuto je da je metodom krioelektronske mikroskopije prevodila biokemija u novo doba, dopuštajući mu da ispuni mnoge praznine u znanju o životnim molekulama i živim sustavima.

Nobelov je odbor smatrao da je najveći doprinos razvoju krioelektronske mikroskopije – metodi koja omogućuje vizualno ispitivanje složene strukture proteina, nukleinskih kiselina i drugih molekula, kao i proučavanje procesa u kojima sudjeluju, koju je izradio Jacques Dubochet, američki njemački podrijetlom Joachim Frank i Scot Richard Henderson.

Odmah nas upozoravamo da je jedva moguće nazvati kriogenu elektronsku mikroskopiju temeljno novu i samodostatnu metodu fizičkog istraživanja tvari. Umjesto toga, to je vrsta prijenosa elektronske mikroskopije (jedan od autora ove metode, Ernst Ruska, dobitnik Nobelove nagrade 1986.), koji je posebno prilagođen za proučavanje mikrobioloških objekata.

Sl. 2. Krioelektronski mikroskop instaliran na Sveučilištu Northwestern u SAD-u. Fotografije iz vox.com

U elektronskom mikroskopu prijenosa, uzorak koji je transparentan elektronima (obično deset i stotinu mikrona) prolazi uzorak elektrona kroz dovoljno tanki elektron koji se prolazi kroz uzorak apsorbira i raspršuje mijenjajući smjer kretanja. Ove se promjene mogu registrirati (sada je CCD matrica, čiji su kreatori Willard Boyle i George Smith osvojili Nobelovu nagradu u fizici 2009.) najčešće se koriste i nakon analize dobivaju sliku predmeta koji se istražuje u ravnini okomito na zraku. Budući da je intrinzična valna duljina elektrona (deseci pikometara u energijamakarakteristična za elektronske mikroskope) mnogo su manja od valnih duljina svjetlosti u vidljivoj regiji (stotine nanometara), pomoću elektronske mikroskopije možete "vidjeti" puno finije detalje nego optičkom mikroskopijom, uključujući fluorescentnu mikroskopiju visoke rezolucije (FVRM), razvijenu 2014. dobitnici Nobelove nagrade u kemiji, Eric Betzig, Stefan Khellem i William Merner.

Ograničavajuća razlučivost elektronskih mikroskopa – nekoliko angstrema (desetine nanometra) gotovo je dosegnuta. To omogućava dobivanje slika u kojima se, na primjer, razlikuju pojedinačni atomi. Za usporedbu: granica mogućnosti fMBP je 10-20 nm. Ali samo usporediti različite metode za krajnju razlučivost je prilično besmisleno. Elektronski mikroskopi imaju visoku rezoluciju, ali se ne mogu uvijek koristiti. Činjenica je da uzorak, osim brušenja tijekom pripreme, prolazi kroz vrlo ozbiljan ozračivanje elektronskom snopom tijekom same studije (otprilike, intenzivniji je snop, manje pogrešaka i bolji rezultat) u vakuumu (potreban je vakuum medij nije raspršio elektrone izvan uzorka, čime je uvedeno nepotrebno iskrivljavanje).Takvi uvjeti potpuno su neprikladni ako trebate proučavati složene biološke molekule i objekte – oštećene su u rijetkim okolišima i u njima postoje mnoge prilično slabe veze koje će jednostavno srušiti tijekom studija.

Razumijevanje da se, bez dodatnih poboljšanja, elektronski mikroskop ne može prilagoditi proučavanju biomolekula i živih sustava, pojavio se gotovo odmah nakon izuma. O tome je, na primjer, napisao tri godine kasnije nakon demonstracije načela rada elektronskog mikroskopa Ernst Ruske 1931. godine, mađarskog fizičara Ladislava Martona (L. Marton, 1934. Elektronska mikroskopija bioloških objekata). U istom članku Marton je predložio načine rješavanja ovog problema. Posebno je istakao da se zamrzavanje uzoraka može smanjiti štetu od zračenja elektronskog snopa. Važno je napomenuti da, iako to nije naznačeno u članku Martona, zamrzavanje uzorka također pomaže smanjenjem toplinske vibracije molekula, što također pridonosi poboljšanju rezultirajuće slike.

U sedamdesetim i osamdesetim godinama znanost i tehnologija dostigle su dostatnu razinu razvoja kako bi se prevladale sve poteškoće. A to je u velikoj mjeri bilo posljedica napora dobitnika ovogodišnje nagrade.

Richard Henderson bio je prvi koji je dobivao sliku asimetričnog proteina atomskom rezolucijom pomoću transmisijskog elektronskog mikroskopa (uz hlađenje uzoraka). Započeo je svoje istraživanje sredinom sedamdesetih godina. I u početku, Henderson je pokušao dobiti strukturu nekoliko proteina iz stanične membrane pomoću metode rendgenske analize, koja je čak i tada mogla rezoluirati od nekoliko angstrema. Međutim, brzo je postalo jasno da ova metoda nije postigla dobar rezultat: tvar koja se razmatra treba biti u kristalnom obliku, a membranski bjelančevine ekstrahirane iz njihova okoliša slabo kristaliziraju ili potpuno gube oblik. Potom se prebacio na elektronsku mikroskopiju.

Odabran je specifičan protein – bakterijskihodopsin – i odlučeno je da se ne uklanja iz membrane, već da ga izravno pregledaju. Znanstvenici su dodatno pokrivali uzorke otopinom glukoze kako bi ih zaštitili od isušivanja u vakuumu. To je pomoglo riješiti problem očuvanja strukture. Tada se Henderson i njegovi kolege suočili s već opisanim problemom uništavanja uzoraka pod djelovanjem elektronske zrake.Pomogao mu je riješiti kombinaciju nekoliko čimbenika.

Prvo, bakterihodopsin se redovito nalazi u membrani pa pažljivo razmatranje ove pravilnosti u kombinaciji sa snimanjem iz različitih kutova pomaže puno pri iscrtanju slike. To je pomoglo da se smanji intenzitet zrake i smanji vrijeme ekspozicije, ali da se poboljša u kvaliteti. Već je 1975. bilo moguće dobiti sliku ovog proteina rezolucijom od 7 angstrema (Slika 3, vidi R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Trodimenzionalni model ljubičaste membrane elektronskom mikroskopijom).

Sl. 3. S lijeve strane: jedan od primarnih "snimaka" bakterijske membrane Halobacterium halobiumkoje je dobila skupina Henderson. Crne crtepoput matirane kose su tragovi bakterijskihhodinskih molekula. Vidljivo je da su uglavnom orijentirani okomito na ravninu slike. Točkasta crta kruži oko procijenjene granice jedne molekule tog proteina. Desno: rezultat trodimenzionalnog modela strukture molekule biorodopsina s rezolucijom od 7 angstrema. Slike iz članka R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Trodimenzionalni model membrane dobiven elektronskom mikroskopijom

Drugo, Henderson je imao priliku putovati u različite znanstvene centre i isprobati različite elektronske mikroskope. Budući da u tim godinama nije bilo ujedinjenja, različiti mikroskopi imali su svoje prednosti i nedostatke: različiti stupnjevi evakuacije komore,različit stupanj hlađenja uzorka (to smanjuje štetu od elektronskog ozračivanja), različite energije elektronskih zraka, različitu osjetljivost detektora. Stoga je mogućnost proučavanja istog objekta na različitim mikroskopima omogućila najprije odabir "najmanje nepovoljnih" uvjeta za dobivanje slike, a zatim ih postupno poboljšavaju. Tako je Henderson prikupio podatke i dobivao više i točniju strukturu bakterenoghodopsina. Godine 1990. objavio je članak u kojem je model ovog proteina predstavljen atomskom rezolucijom (R. Henderson i dr., 1990.).

Sl. 4. Model bakterihhodopsina dobiven pomoću elektronske mikroskopije prijenosa – primjenom ovog spoja, Richard Henderson je pokazao mogućnost korištenja metode dobivanja slika bioloških objekata s atomskom rezolucijom. Debeli niz različitih boja – kemijske veze između atoma bakterinhidroksina, bijele mrežaste površine pokazuju granice gustoće elektrona oko atoma i atomske skupine. Slika iz R. Henderson i dr., 1990. Model za strukturu bakterinhodopina baziran na krio-mikroskopiji elektrona visoke rezolucije

Tijekom ove pionirske studije, Henderson je pokazao da krioelektronska mikroskopija može proizvesti slike rezolucijom,što nije niže od metode rendgenske analize – u to je vrijeme bio proboj. Međutim, ovaj rezultat je u osnovi koristio činjenicu da se bakterihodopsin redovito nalazi u staničnoj membrani, i nije bilo jasno bi li bilo moguće postići takvu rezoluciju za druge, "nepravilne" molekule.

Problem obrade slabih signala iz slučajnih biološki aktivnih molekula riješen je još jedan dobitnik Nobelove nagrade za 2017., Joachim Frank. Njegov glavni doprinos krioelektronskoj mikroskopiji je stvaranje algoritama za analizu dvodimenzionalnih slika dobivenih pomoću krioelektronske mikroskopije, što nam omogućuje da izgradimo visokokvalitetni trodimenzionalni model. Slični algoritmi već su razvijeni za druge metode mikroskopije. Frank je optimizirao i na mnogo načina pročistio metode matematičke analize koje omogućuju odvajanje korisnih informacija dobivenih tijekom elektronske mikroskopije od signala uzrokovanih buke. U preciznim elektronskim uređajima nastaju šumovi iz raznih razloga: slučajne fluktuacije struje i napona mogu biti posljedica neujednačene emisije elektrona u blokovima elektroakvaja,nepravilnosti u formiranju i rekombiniranju nosača punjenja (elektroda provrta i rupa) u poluvodičkim blokovima, toplinsko kretanje strujnih nosača u vodičima (toplinski šum) ili vanjske smetnje (unatoč tome što je sve dobro izolirano).

Sl. 5. Metode izračunavanja signala u krioelektronskom mikroskopiju, predložio J. Frank. Shema iz stranice nobelprize.org

Zadaća je također komplicirana. Ako su predmeti, čak i ako su isti ili otprilike isti, kao što bi trebali biti u takvim istraživanjima, poremećeni, oni daju malo različite signale u strukturi koji mogu zamagliti jedan drugoga. Štoviše, uzrok takvog blur-šuma ili algoritam pogreške – nije lako odrediti. Shematski, načelo obrade podataka prikazano je na sl. 5: brojne ravne slike proučene molekule brišu se od buke i tipiraju prema "kutovima", a zatim se dobiva kvalitetniji profil s slika s bliskim kutovima, a na kraju se izrađuje trodimenzionalni model iz tih profila.

Godine 1981. Frank je sažetak matematičkih modela u prvoj verziji računalnog programa SPIDER (Sustav za obradu slikovnih podataka iz elektronske mikroskopije i srodnih područja, prva publikacija: J.Frank i sur., 1981. Spider – Modularni softverski sustav za obradu elektronske slike). Ovaj programski paket postoji i ažuriran je do sada, štoviše, ti programi su besplatni za distribuciju, što nedvojbeno olakšava rad znanstvenika širom svijeta. Frank je koristio svoje algoritme za dobivanje slike površine ribosoma – koji se sastoji od niti RNA i njegovih povezanih organoidnih proteina koji se koriste za biosintezu proteina iz aminokiselina na osnovi genetske informacije.

Sl. 6. Metoda pripreme uzorka za krioelektronsku mikroskopiju, koju je predložio J. Dubcecher. Shema iz stranice nobelprize.org

prefiks "Cryo" pojavio se u elektronskom mikroskopiju zahvaljujući trećem laureatu, Jacquesu Dubocheu. Razvio je metodu brzog hlađenja vodenih otopina s uzorcima (J. Dubochet, A.W. McDowall, 1981. Vitrifikacija vode za elektronnu mikroskopiju). Štoviše, voda bi trebala zamrznuti tako brzo da molekule nisu imale vremena da se stave u kristalnu rešetku, kao što je bilo zamrznuto (vidi amorfni led). To se postiže brzo uranjanjem tankog filma otopine s uzorkom u spremniku s tekućim etanom ohlađenim na -160 ° (slika 6). Ispravna metoda zamrzavanja može se nazvati ključom uspjeha cijele metode, jer naređeni kristali leda mogu uzrokovati difrakciju elektrona, iskrivljujući informacije o molekulama koje se istražuju.Zbog velike molekularne težine proteina i nukleinskih kiselina, te molekule su nespretne, tako da s trenutnim zamrzavanjem nemaju vremena ni promijeniti položaj niti promijeniti oblik. To jest, struktura biološki aktivnih molekula tijekom brzog zamrzavanja ovom metodom se ne mijenja. Korištenjem toga, Dubboche je prvi put primijenio krioelektronsku mikroskopiju za proučavanje strukture virusa (Slika 7, vidi M. Adrian i sur., 1984. Krikom-elektronna mikroskopija virusa).

Sl. 7. S lijeve strane: Slika bakteriofaga T4, dobivena od skupine J. DuBoche. U potpunosti možete razlikovati nekoliko virusnih čestica. Desno: trodimenzionalni model ovog virusa. Slika iz članka M. Adrian et al., 1984. Elektronska mikroskopija virusa i znanstvenih slika

Tijekom 1990-ih i 2000-ih, krioelektronska mikroskopija postupno se razvija i poboljšava razvojem računalne snage i instrumenata preciznosti. Ali pravi cvjetanje mikroelektrične krioelektronike počinje 2012. godine. Povezan je s pojavom izravnih elektroničkih detektora temeljenih na CMOS-u, koji mogu izravno otkriti elektrone koji su prolazili kroz uzorak. To nam je omogućilo pojednostavljenje dizajna elektronskih mikroskopa, uklanjanje složenih sustava fokusiranja i konverzije signala te smanjenje broja čvorova koji mogu proizvesti slučajnu buku.Kao rezultat toga, rezolucija metode krioelektronske mikroskopije povećana je na 2-3 angstrema (Slika 8).

Sl. 8. Napredak u poboljšanju rezolucije krioelektronske mikroskopije tijekom proteklih nekoliko godina na primjeru enzima beta-galaktozidaze. Slika iz vox.com

Tako je 2017. godine, gotovo šest desetljeća nakon kristalografskog određivanja strukture hemoglobina Max Perutz (Max Perutz i John Kendru "dobio Nobelovu nagradu u kemiji 1962 za istraživanje strukture globularnih proteina), krioelektronska mikroskopija omogućila je proučavanje jedne molekule tog proteina u kristalu, i u otopini (Slika 9).

Sl. 9. iznad: radiografija kristala hemoglobina, slika iz članka J. D. Bernala, I. Fankuchena i Max Perutza, 1938. Eksplozivna analiza kimotripsina i hemoglobina (na lijevoj strani) i rekonstruiran na 3D strukturu roentgenograma molekule hemoglobina (s desne strane). ispod: različite projekcije molekule hemoglobina dobivene pomoću krioelektronskog mikroskopa (na lijevoj strani) i trodimenzionalni model ove molekule (s desne strane), slike M. Khoshouei i sur., 2017. Cryo-EM struktura hemoglobina na 3.2 EE određena je s Volta faznom pločom. Gornji desni dio: model hemoglobin molekule iz rcsb.org

Točne informacije o strukturi biološki aktivnih spojevaosobitosti njihova međudjelovanja i njihovog sudjelovanja u biokemijskim procesima važni su i u temeljnim pojmovima i rješavanju praktičnih problema, primjerice u razvoju novih lijekova i stvaranju novih metoda liječenja bolesti.

Jedan od primjera praktične primjene krioelektronske mikroskopije na ovom području može se smatrati proučavanjem virusa Zika (slika 10). Tijekom izbijanja Zike-ove epidemije u Brazilu 2016. godine, istraživači su proveli nekoliko mjeseci dobivajući informacije o strukturi virusa pomoću krioelektronske mikroskopije (D. Sirohi et al., 2016. Krioko-EM struktura Zika virusa od 3,8 Å).

Sl. 10. Struktura virusa Zika određena pomoću krioelektronske mikroskopije. Slika iz virologije.ws

Drugi je primjer da je ove godine krioelektronska mikroskopija omogućila dobivanje strukture kapsida najvećeg predstavnika obitelji herpes virusa – humanog citomegalovirusa (X. Yu et al., 2017.). Rezultati studije postali su temelj za traženje mogućih dijelova kapsida virusa koji bi mogli postati molekularni ciljevi antivirusnih lijekova.

Arkadij Kuramshin


Like this post? Please share to your friends:

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: